作者，Evil Genius
现在发一篇NC也是相当不容易啊，今天我们分享文献
是一篇10Xvisium call mutation的文章，值得大家借鉴。
多组学是未来的方向，大家如果对基因组 + 单细胞空间组的联合分析感兴趣，可以参加一下生化小课---基因组与单细胞空间多组学
知识积累
皮肤鳞状细胞癌（cSCC）起源于皮肤角质形成细胞，完全演化的皮肤鳞状细胞癌常出现破坏p53和Notch信号通路的体细胞突变。
此外，它们还可能存在激活MAPK/PI3激酶通路、上调端粒酶活性、扰乱SWI/SNF染色质重塑复合物、破坏细胞周期检查点调控及/或抑制Hippo信号通路等突变。
皮肤鳞状细胞癌起源于表皮角质形成细胞。携带p53或Notch突变的角质形成细胞克隆斑块可见于表皮中，其密度随累积日光暴露量增加而升高。日光性角化病作为皮肤鳞癌的低风险癌前病变，很可能源于这些克隆斑块。尽管已有研究对日光性角化病进行测序分析，但由于其复杂的克隆结构，其遗传驱动因素仍未完全阐明。
结果1、正常人类皮肤单个角质形成细胞的突变谱研究总结
研究对从正常人体皮肤分离的单个角质形成细胞的突变谱进行了系统性分析，并与同一活检样本中的黑色素细胞和真皮成纤维细胞进行比较。
技术流程：采用改良的单细胞基因分型工作流程。通过体外克隆扩增单个皮肤细胞，获取足量DNA/RNA后进行测序，并结合生信分析以高特异性鉴定体细胞突变。
潜在偏差：克隆扩增过程可能对能成功生长并用于分析的细胞类型产生选择偏倚。为减少偏差，研究优化了培养条件，并比较了单细胞与bulk测序结果，以评估不同方法对突变检测的可能影响。
样本来源：来自15名供者的22份皮肤活检，共分析了137个角质形成细胞、131个黑色素细胞和23个成纤维细胞。
取样部位：涵盖不同习惯性日光暴露程度的部位（臀部、躯干、头/颈部）。
核心发现
突变负荷的细胞类型差异
角质形成细胞的中位突变负荷最低（1.14 突变/Mb），显著低于黑色素细胞（3.91 突变/Mb）和成纤维细胞（1.92 突变/Mb）。
这种差异在同一活检内的不同细胞类型间也存在，提示是细胞类型本身的特性，而非个体间差异。
日光暴露皮肤（如上背部）的角质形成细胞突变负荷高于防晒部位（如臀部），但其差异幅度远小于其他细胞类型（尤其是黑色素细胞）。
角质形成细胞内的异质性及关键突变的影响
尽管大多数角质形成细胞突变负荷较低，但部分细胞负荷极高（最高达49.71 突变/Mb）。
关键发现：所有突变负荷 >3.5 突变/Mb 的角质形成细胞，均携带至少一个已知的皮肤鳞癌致病突变。其中，携带具有显性负效应的TP53错义突变的细胞，其突变负荷最高。
这表明：野生型角质形成细胞（即无致病突变）具有强大的适应机制以维持低突变负荷；而某些致病突变（如TP53突变）会破坏这种机制，诱导产生“突变表型”。
突变特征分析
角质形成细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的突变类型存在差异。
虽然角质形成细胞中也存在与紫外线相关的SBS7a特征，但其在总突变中的占比低于黑色素细胞和成纤维细胞。
角质形成细胞中，与衰老和细胞分裂累积相关的“时钟样”特征（SBS1、SBS5）所占比例更高。
关于突变负荷维持机制的探讨
野生型角质形成细胞如何在长期环境暴露中维持低突变负荷，机制尚不完全清楚。
研究进行了体外UV照射实验，发现存活的角质形成细胞比存活的黑色素细胞积累了更多突变。这提示体内机制可能更为复杂，涉及三维结构、慢性暴露及细胞选择性清除等。
与bulk测序的比较及拷贝数变异
单细胞测序显示的突变类型与已发表的表皮bulk测序数据高度一致，但单细胞检测到的平均每细胞突变负荷低于基于bulk数据推断的数值。差异可能源于随机抽样、表皮中其他高突变细胞类型的混杂，或克隆扩增对低突变细胞的偏好。
体细胞拷贝数改变在正常皮肤细胞中不常见（角质形成细胞中发生率5.8%），且通常只影响基因组的小部分区域，表明染色体不稳定性并非正常皮肤细胞的主要突变机制。
正常皮肤角质形成细胞普遍具有较低的体细胞突变负荷，显示出对UV损伤的强大耐受或修复能力。然而，一旦获得特定的驱动基因突变（如TP53），这种稳态将被打破，导致突变率急剧升高，这可能是皮肤鳞癌发生的关键早期事件。角质形成细胞在突变特征和负荷维持机制上，与同处表皮基底层、接受相似UV剂量的黑色素细胞存在显著差异。
角质形成细胞克隆性扩增及其与突变的关系
核心发现：研究发现，来自同一活检样本的角质形成细胞之间存在共享的体细胞突变，这证实了它们具有克隆相关性，即来源于同一个祖细胞。
角质形成细胞在正常皮肤中存在广泛的克隆性扩增。尽管某些驱动基因突变（如TP53）会显著提高单个细胞的突变负荷，但它们并未赋予该突变克隆明显的生长优势，使其在面积上显著超过周围的正常细胞克隆。这提示，在癌前病变阶段，这些初始驱动突变可能主要作用是破坏基因组稳定性（诱导突变表型），而非直接驱动克隆的快速扩张。
结果2、驱动光化性角化病进展为鳞状细胞癌的遗传改变
通过病理标记区分组织区域，并对DNA进行深度测序（使用癌症基因panel）。
病灶间的克隆关系复杂：
出乎意料的是，在16例中有6例，相邻的AK与cSCC不共享任何体细胞改变，表明它们是独立起源的克隆，尽管位置毗邻。
在另外4例中，cSCC区域没有发现独特的突变，暗示AK和cSCC属于同一个克隆细胞群，组织学差异可能源于表观遗传或肿瘤微环境因素，而非新的遗传驱动事件。
明确从AK进展的cSCC的遗传演变路径：
在剩余5例明确由AK进展而来的cSCC中，通过分析共享和独有的突变，构建了进展的遗传图谱。
示例病例分析：
AK阶段已存在：TP53、NOTCH1、NOTCH2和CDKN2A的功能丧失突变，以及TERT启动子的功能获得突变。
进展至cSCC阶段新增：ARID2（破坏SWI/SNF染色质重塑复合物）和CBL（激活MAPK信号通路）的功能丧失突变。
未检测到明显的拷贝数变异，但发现影响CDKN2A基因的9p染色体臂等位基因失衡。
免疫组化验证：p53阳性存在于AK和cSCC；磷酸化MAPK信号在cSCC中更强，与CBL突变相符。
AK向cSCC的转化并非必然的线性过程，相当比例的相邻病灶为独立克隆。在明确进展的病例中，AK阶段已积累TP53、NOTCH通路和CDKN2A等关键驱动突变及TERT激活；而向侵袭性cSCC的过渡，则可能由额外的、涉及染色质重塑（如ARID2）和MAPK通路激活（如CBL）的遗传事件驱动。组织学差异有时可能不依赖于新的遗传驱动突变。
分析了一项已发表的公开研究数据，该研究对皮肤鳞状细胞癌（cSCC）及相邻皮肤（包括日光暴露皮肤、光化性角化病（AK）或原位鳞癌）中的160个已知癌症基因进行了测序。分析结果与本研究观察到的模式一致：多数病例中鳞癌与邻近皮肤克隆无关，部分病例中鳞癌可能向相邻区域延伸，仅少数病例（3例）明确显示鳞癌由邻近癌前病变演化而来。
综合本研究5例及公开数据3例（共8例明确由癌前病变演化的鳞癌），发现了共同的演变规律：p53与NOTCH通路突变、细胞周期检查点失活及端粒酶上调等改变位于系统发育树主干，驱动光化性角化病形成；而SWI/SNF染色质重塑复合物破坏及RAS/MAPK/PI3K信号通路激活的突变则集中出现在向鳞癌转化的阶段。
通过对比未匹配队列中完全演化鳞癌与正常皮肤的驱动突变频率，进一步验证：TP53和NOTCH突变在正常皮肤中已较常见，属于早期选择事件，其中TP53突变虽在正常皮肤中少于NOTCH1突变，却在鳞癌中更常见，提示其赋予角质形成细胞更强的恶性潜能；而CDKN2A、ARID2等基因突变在正常皮肤中罕见却在鳞癌中常见，表明它们属于肿瘤演化后期的选择事件。需注意，因正常皮肤数据使用小基因panel测序，此比较存在一定局限性。
结果3、对鳞状细胞癌邻近光化性角化病的空间转录组学分析
为解析肿瘤演化过程中的基因表达变化，研究对5例克隆关系已明确的、邻近光化性角化病（AK）的鳞状细胞癌（cSCC）样本进行了空间转录组学（10X Visium）分析，以克服传统bulk RNA测序无法解析克隆空间关系的局限。
揭示肿瘤克隆的复杂空间结构
通过从Visium数据中推断拷贝数变异，发现了与DNA测序数据一致的克隆特征。
关键发现：空间数据揭示了卫星克隆细胞群的存在，它们在物理位置上远离主肿瘤病灶，这与DNA测序中观察到的区域间低水平交叉污染现象相符。
解析肿瘤内部的细胞状态异质性
spot聚类主要依据细胞类型，其次为细胞状态。
与bulk数据一致，cSCC区域平均表达更高水平的干细胞、祖细胞和间充质基因。
重要的空间异质性：具有干细胞样特征的spot只存在于cSCC的侵袭前沿（即先前定义的肿瘤特异性角质形成细胞TSKs）。
无论是AK还是cSCC的较深区域，都保留了与基底层、基上层、棘层和角质细胞分化相关的基因表达程序，表明肿瘤保留了广泛的上皮细胞状态谱系，即使肿瘤进展，其层级分化程序依然存在。
揭示肿瘤微环境的空间异质性
免疫细胞分布：免疫浸润常见于AK和cSCC的边界区域。
免疫检查点分子的空间表达：
在cSCC的侵袭前沿，肿瘤细胞高表达免疫检查点配体（如PVR, NECTIN2, CD274, CD80, CD86）。
相应地，该区域的淋巴细胞也高表达免疫检查点蛋白（如CTLA4, TIGIT, PDCD1）。这提示肿瘤侵袭前沿存在强烈的免疫调节相互作用。
局限性：本研究分析的cSCC在组织病理学上均为高分化。未来需要纳入分化表型更广的肿瘤，以更好地刻画瘤内异质性。同时，未来研究需要对更多具有明确系统发育关系的cSCC-癌前病变配对样本进行分析，以阐明免疫表型在进展过程中的演变。
总结一下
关键驱动突变的时序与功能
早期启动（癌前阶段）：
TP53和NOTCH1突变在正常表皮角质形成细胞中已出现，其主要作用并非直接赋予克隆生长优势（突变克隆大小并未更大），而是诱导“突变表型”，显著提高细胞的突变积累速率，为癌变储备遗传变异。
FAT1突变（抑制Hippo通路）在正常表皮中亦有发现。
癌前病变形成（光化性角化病/AK阶段）：
CDKN2A功能丧失突变和TERT启动子突变在AK中反复出现，是促进肿瘤形成的重要步骤。
恶性转化（进展为cSCC阶段）：
ARID2突变（破坏SWI/SNF染色质重塑复合物）和RTK-RAS-MAPK通路的功能获得性突变在AK向cSCC的转化阶段特异性富集，是驱动侵袭性癌变的关键晚期事件。
肿瘤克隆的空间结构复杂性
cSCC常与邻近的癌前病变（AK）无克隆相关性，表明皮肤上常同时存在多个遗传上独立的肿瘤性增殖克隆，并可能发生“碰撞”。
空间转录组分析显示，肿瘤区域是肿瘤性克隆与非肿瘤性克隆的复杂嵌合体，克隆边界在二维空间上不连续。这提示组织学边界可能无法准确反映肿瘤的真实范围，对临床评估具有重要意义。
肿瘤微环境与免疫互作
肿瘤内存在显著的基因表达空间异质性。AK和cSCC内部均保留了类似于正常表皮的分化层级结构，但cSCC细胞整体分化程度更低。
免疫浸润的组成在肿瘤内部存在差异。在cSCC的侵袭前沿，肿瘤细胞高表达免疫检查点配体，而该区域的淋巴细胞也高表达相应的免疫检查点蛋白。
这表明免疫应答在AK阶段即已启动，可能形成了致癌增殖与免疫清除的平衡状态。而向cSCC的进展可能涉及获得通过免疫检查点进行免疫逃逸的能力。SWI/SNF复合物突变在此转化阶段常见，可能与驱动免疫逃逸有关。
临床转化展望
本研究鉴定出的遗传改变有望作为改进角质形成细胞癌诊断和预后的候选生物标志物。
鉴于临床上正常的皮肤中广泛存在具有高突变负荷的TP53突变角质形成细胞，未来研究可探索免疫疗法是否也能靶向并清除这些癌前细胞，作为一种潜在的预防策略。
最后来看看方法
